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Al estallar la Guerra Civil en 1936 fue uno de los principales protagonistas de los sucesos revolucionarios de julio, formando parte el grupo "Nosotros" (sucesores de "Los Solidarios") de la dirección de la defensa de la ciudad de Barcelona, en la cual falleció su compañero de toda la vida Francisco Ascaso por un disparo procedente del bando nacional. El 20 de julio, ya derrotado el alzamiento en Barcelona y siendo la CNT la dueña de la situación, sobre todo tras apoderarse del parque de Artillería de San Andrés, sus principales dirigentes tuvieron una entrevista con el presidente de la Generalitat catalana, Lluis Companys. En una segunda entrevista al día siguiente, después del pleno de Federaciones locales de la CNT, Durruti junto con otros principales dirigentes de la CNT propusieron nombrar un Comité Central de Milicias Antifascistas de Cataluña, siendo aceptado por las restantes organizaciones. Este comité (formado por libertarios, republicanos nacionalistas y marxistas) se convirtió en el verdadero poder en Cataluña, ratificando la Generalitat posteriormente lo que se decidia. Cansado de las disputas internas y el desgaste debido al hecho de encontrarse en una guerra civil, del Comité de Milicias Antifasciastas (de la cual era jefe del departamento de transportes), decidió pasar al frente con el bando republicano, empezando por liberar de los nacionales Zaragoza, tras Barcelona, otro gran núcleo urbano anarquista. Se formó entonces la famosa Columna Durruti, que tomó rumbo a Zaragoza.

Lápida y tumba de Buenaventura Durruti en el Cementerio de Montjuic (Barcelona)A la columna se le negó el suministro de armas, artillería, etcétera, por parte de los agentes comunistas, por lo que tuvo que limitarse a tomar todos los pueblos por donde pasaba. En ellos los campesinos se veían libres para hacer la revolución: los terratenientes eran expropiados de sus tierras, las cuales eran colectivizadas, se abolía la propiedad privada y se instauraba el comunismo libertario. En noviembre de aquel año marchó a Madrid con su columna a contener la ofensiva de las tropas sublevadas (batalla de Madrid).

Cuando se encontraba en las proximidades del Hospital Clínico de Madrid (ocupado por los sublevados) fue herido mortalmente por un disparo cuya procedencia no está muy clara, existiendo diversas hipótesis sobre el origen de la bala que le hirió. Mientras algunas versiones afirman que fue disparada accidentalmente por su propio "naranjero" (versión española del subfusil Schmeisser MP28 II), otras apuntan a que pudo ser asesinado por agentes estalinistas. La versión del accidente es bastante verosímil, por cuanto el citado modelo de subfusil carecía de seguro y podía disparse por un simple golpe de la culata contra el suelo. Joan García Oliver, compañero de Durruti desde los tiempos de Los Solidarios, nos explica en su libro autobiográfico "El Eco de los Pasos", y que fue la persona que acompaño a Durruti al frente de Madrid, vivo, y que lo acompaño de regreso a Barcelona, muerto, que nunca quiso creer está historia pues Durruti nunca en su vida usó naranjero, el mismo García Oliver nunca lo vio con ninguno, usaba pistola, ni tampoco en fotografía,recordando que Durruti se hacía acompañar permanentemente de un fotógrafo y un médico. Según Abel Paz,anarquista y biógrafo de Durruti, la bala le entró por detrás, con lo que, por muy peligrosos que fueran los naranjeros, era impossible sostener la teoría defendida por el PCE.

Aun así, el posterior asesinato de Andreu Nin, líder del POUM, partido marxista-leninista y de cariz antiestalinista, por parte del NKVD, refuerza la sospecha que Durruti también fue asesinado por el régimen de la URSS.